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　　背景技术 [0002] 细胞治疗是继手术、放疗和化疗之后的又一种肿瘤治疗方法，它一般作为手术、放 化疗的辅助手段，延长患者的寿命，清除体内手术后残余的肿瘤细胞。NK细胞是一类无主要 组织相容性复合物(MHC)限制性、能直接杀伤靶细胞的特殊淋巴细胞群体，被认为是肿瘤免 疫治疗的重要效应细胞，它不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下 参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。外 周血中的NK细胞数量非常有限 ，所以限 制了NK 细胞的临床应用。当今获得临床级NK细胞的方法是体外培养，即分离患者外周血的单个核 细胞进行诱导和扩增 ，使其增加数百甚至数千倍并且细胞毒性得到很大的提高 ，再把NK细 胞回输到患者的 体内 ，但是常规的NK细胞的 制备方法并不理想 ，目前国内体外培养NK细胞 方法主要有以 下几 种方法 ：一种是采 用滋养层细胞扩增NK细胞方法 ，即将单个核细胞与肿 瘤细胞株(如K562细胞株)混合培养诱导扩增NK细胞。此方法虽然可以大大增强NK细胞杀瘤 性和增殖率，但在培养过程中引入了肿瘤细胞，虽经过致死剂量的γ射线照射，如果发生存 活的 滋养层细胞随 细胞一起进入人体会存在安全隐 患。另一种方法采 用免疫磁珠法 ，这种 方法分离出的 细胞虽然纯度较高 ，但大大 增加了研究成本 ，而且因为缺乏成熟的分选后体 外培养工艺 ，所以 很难在体外扩增 ，无法满足临床回输所需的 细胞数量。因此 ，国内目 前的 NK细胞培养试剂盒或NK细胞培养方法在细胞数量、细胞纯度和杀瘤性上不能满足临床和科 研需要。

　　1)用终浓度0 .01-10μg/ml的HER-2抗体在4℃下包被培养瓶； 2)获得分离的单个核细胞； 3) 用干细胞生长培养基将上述步骤2)中获得的分离的单个核细胞调整至1×106至2× 106个/ml的 密度 ，并 加入到步骤1)的HER-2抗体包被的培养瓶中 ，向培养瓶中 加入终浓度为 1-100μg/ml的α-甘露聚糖肽；在适合细胞生长的条件下培养； 4)培养3-5天后，向步骤3)获得的培养物中加入干细胞生长培养基，并加入兔抗人胸腺 细胞免疫球蛋白至终浓度10-2000ng/ml，在适合细胞生长的条件下继续培养； 5)继续培养3-5天后，向步骤4)获得的培养物中加入含有终浓度2-200ng/ml的IL-15和 终浓度100-10000IU/ml的IL-2的X-VIVO-15无血清培养基，并加入5％灭活血浆，在适合细 胞生长的条件下继续培养； 6)继续培养3-5天后，向步骤5)获得的培养物中加入含有终浓度2-200ng/ml的IL-15和 终浓度100-10000IU/ml的IL-2的X-VIVO-15无血清培养基，在适合细胞生长的条件下继续 培养； 7)重复步骤6)1-10次，获得高纯度的NK细胞。 2 .根据权利要求1所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其 中步骤2)中的单个核细胞分离自哺乳动物的外周血或脐带血。 3 .根据权利要求2所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其 中所述哺乳动物是非人哺乳动物。 4 .根据权利要求2所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其 中所述哺乳动物是人。 5 .根据权利要求1-4中任一项所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞 的方法，其中步骤1)中的HER-2抗体的终浓度为0 .1μg/ml，步骤3)中的α-甘露聚糖肽的终浓 度为10μg/ml，步骤4)中的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白终浓度为100ng/ml，步骤4)-7)中的 IL-15终浓度为20ng/ml以及步骤4)-7)中的IL-2终浓度为1000IU/ml。 6 .根据权利要求5所述的体外诱导扩增单个核细胞以获得高纯度的NK细胞的方法，其 中在步骤7)中重复步骤6)3、4或5次。 7 .用于诱导分化NK细胞的HER-抗体和α-甘露聚糖肽以及用于扩增NK细胞的兔抗人胸 腺细胞免疫球蛋白、IL-15和IL-2在制备用于权利要求1-6中任一项所述的方法中的试剂盒 中的用途。 8 .一种用于权利要求1-6中任一项所述的方法中的试剂盒，其包含：用于诱导分化NK细 胞的HER-抗体和α-甘露聚糖肽以及用于扩增NK细胞的兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白、IL-15 和IL-2。 9 .根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含干细胞培养基和X-VIVO-15无 血清培养基。 10 .根据权利要求1-6中任一项所述的方法获得的高纯度的NK细胞在制备用于治疗肿 瘤的药物中的用途。